--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱： MDA-MB-231(人乳腺癌細(xì)胞)

細(xì)胞別稱： MDA-MB 231; MDA.MB.231; MDA MB 231; MDA MB231; MDA Mb231; MDA-MB231; MDAMB-231; MDAMB231; MDA-231; MDA231; MB231; MD Anderson-Metastatic Breast-231

細(xì)胞貨號(hào)： SNL-073

生長(zhǎng)特性： 貼壁

培養(yǎng)條件： L15+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，100%； 37℃

細(xì)胞簡(jiǎn)介： MDA-MB-231細(xì)胞來自患有轉(zhuǎn)移性乳腺腺癌的51歲女性病人的胸水，在裸鼠和ALS處理的BALB/c小鼠中，MDA-MB-231細(xì)胞能形成低分化腺癌（III級(jí)）。MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)EGF、TGF-α、表達(dá)WNT7B癌基因。MDA-MB-231細(xì)胞是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

細(xì)胞正常生長(zhǎng)形態(tài)照 

MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

l 使用L15培養(yǎng)基時(shí)不可通入二氧化碳

Leibovitzs-15（L15）培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)由磷酸鹽和游離堿基氨基酸組成，代替了傳統(tǒng)的碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)，因此適合于空氣培養(yǎng)環(huán)境。若您使用L15培養(yǎng)基培養(yǎng)MDA-MB-231，培養(yǎng)箱不可通入CO2；如果必須要通CO2，可使用密閉蓋培養(yǎng)瓶。

l 可用DMEM代替L15

MDA-MB-231細(xì)胞可以用DMEM+10%FBS+1%PS培養(yǎng)體系，若要從L15培養(yǎng)體系替換為DMEM，直接換即可，無需將兩種培養(yǎng)基混合過渡。DMEM含碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng)，使用時(shí)需要通入5% CO2。

l 細(xì)胞生長(zhǎng)較慢

MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)偏慢，注意控制細(xì)胞接種密度不要過低。推薦傳代比例為1：2。

l 對(duì)機(jī)械損傷敏感

MDA-MB-231細(xì)胞在消化吹打時(shí)易受損，需要精細(xì)的控制消化操作，吹打次數(shù)不宜過多，控制吹打力度輕柔。若控制不好，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常、生長(zhǎng)速度減慢甚至無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。（詳細(xì)傳代步驟見下文）

MDA-MB-231細(xì)胞傳代方法

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）

2. 抽走培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，加5mL PBS潤(rùn)洗1-2遍，清除殘留培養(yǎng)基；

3. 盡量吸干潤(rùn)洗的PBS后加1mL胰酶，搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底，放置培養(yǎng)箱37℃消化；

4. 消化時(shí)每隔30s拿出來觀察，消化到細(xì)胞明顯回縮，間隙變大，但未完*脫落時(shí)立即加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹落貼壁的細(xì)胞；

Tips：注意控制吹打力度輕柔，吹打次數(shù)不可過多，避免機(jī)械損傷

5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm，3min離心收集細(xì)胞；

6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

7. 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣；

Tips：首*傳代建議1:2。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度時(shí)即可傳代

MDA-MB-231細(xì)胞凍存方法

1. 配制程序性凍存液，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量?jī)龃婀懿⒆龊脴?biāo)記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心、棄上清，獲得細(xì)胞沉淀；

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置

Tips：

l 液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長(zhǎng)期保存。

l 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請(qǐng)按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。

l T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿通常可凍存2-3管，10cm皿長(zhǎng)滿通?？蓛龃?-4管。

l 凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。

MDA-MB-231細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；

2. 將細(xì)胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

l 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。

l 凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會(huì)待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù)，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。

l 水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異

4. 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；

5. 復(fù)蘇24h后觀察并換液一次，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips：整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

MDA-MB-231細(xì)胞收貨攻略

l 常溫細(xì)胞

1. 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

l 凍存細(xì)胞

1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存，若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；

2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；

3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

常見問題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計(jì)算的？

嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久？

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完*規(guī)定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。 

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