--細(xì) 胞 基 本 信 息---
細(xì)胞名稱: NK-92(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞)
細(xì)胞別稱: NK92; Natural Killer-92; NK-92.05; Neukoplast; aNK
細(xì)胞貨號: SNL-405
生長特性: 懸浮
培養(yǎng)條件: MEMα+20% FBS+0.2mM Inositol+0.1mM β-mercaptoethanol+0.02mM Folic Acid+100-200U/mL recombinant IL-2+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣,95%; 二氧化碳 (CO2),5%;37℃
細(xì)胞簡介: NK-92細(xì)胞是從一位患有急進(jìn)性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細(xì)胞衍生來的一株IL-2依賴型NK細(xì)胞株。NK-92細(xì)胞對很多惡性細(xì)胞有細(xì)胞毒性,鉻釋放試驗(yàn)顯示它能殺死K562細(xì)胞和Daudi細(xì)胞。NK-92細(xì)胞(經(jīng)過照射以防止增殖)可以有效地用于血液中白血病的體外免疫清掃而不危及血細(xì)胞的功能。NK-92細(xì)胞有以下特征:CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面標(biāo)記陽性;CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面標(biāo)記陰性。NK-92細(xì)胞依賴于重組IL-2的存在,低至10U/mL的劑量足以維持增殖;在缺乏IL-2的情況下,細(xì)胞將在72小時內(nèi)死亡。ATCC通過PCR證實(shí)該細(xì)胞系Epstein-Barr病毒DNA序列呈陽性。NK-92細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)研究、毒理研究,也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
細(xì)胞正常生長形態(tài)照片
NK-92細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)
l NK-92細(xì)胞呈聚團(tuán)懸浮生長,細(xì)胞團(tuán)較大時需要吹打成小團(tuán),防止團(tuán)塊中間的細(xì)胞因營養(yǎng)不足而死亡。除非實(shí)驗(yàn)需要,不建議經(jīng)常將細(xì)胞吹散成單個細(xì)胞,否則細(xì)胞狀態(tài)將變差;
l NK-92細(xì)胞對培養(yǎng)基和血清要求高,培養(yǎng)基嚴(yán)格按照配方配制,并且應(yīng)該使用優(yōu)質(zhì)血清進(jìn)行培養(yǎng);
l NK-92細(xì)胞對IL-2有依賴性,如果缺少IL-2細(xì)胞將很快死亡。需注意IL-2容易降解,若購買商品化完*培養(yǎng)基,要保存得當(dāng)并在保質(zhì)期內(nèi)盡快用完;若自己配制培養(yǎng)基,IL-2可以采用現(xiàn)配現(xiàn)用的方法;
l 建議常備IL-2,當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳時,額外向培養(yǎng)基中按200U/mL補(bǔ)充IL-2,可有效改善。
l NK-92細(xì)胞對吹打等機(jī)械刺激敏感,不要吹打太多次,注意控制吹打力度輕柔;
l NK-92細(xì)胞對溫度敏感,培養(yǎng)基、PBS需復(fù)溫至37℃再使用。
l NK-92細(xì)胞凍存難度較大,建議使用90% FBS+10%DMSO凍存液,凍存密度推薦300萬細(xì)胞/毫升,不能過低。凍存液中不必加IL-2。凍存時細(xì)胞應(yīng)吹散成單細(xì)胞。
l NK-92細(xì)胞計(jì)數(shù)時算得的細(xì)胞的活率不能代表該細(xì)胞真實(shí)的狀態(tài)。因?yàn)榕囵B(yǎng)時存在一些散在的單細(xì)胞,這些細(xì)胞活性較低,且不能完*去除,導(dǎo)致在計(jì)數(shù)時細(xì)胞整體活率可能不高。細(xì)胞狀態(tài)可以通過細(xì)胞能否聚團(tuán)判斷:只要大部分細(xì)胞能聚團(tuán)生長,細(xì)胞狀態(tài)就沒有問題。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳時,細(xì)胞無法順利聚團(tuán)。
NK-92細(xì)胞換液方法
l 半換液法:
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預(yù)熱)
2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時間,待細(xì)胞沉底;(肉眼觀察細(xì)胞沉底情況)
3. 吸頭緊貼液面,小心吸出一半的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移到離心管;
4. 900-1000rpm 3min離心,離心管里若有細(xì)胞,則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶;
5. 原瓶補(bǔ)充一半的新鮮培養(yǎng)基。
Tips:建議半換液2-3次后進(jìn)行離心換液。
l 離心換液法:
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預(yù)熱)
2. 將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中;
3. 900-1000rpm,3min離心;
4. 棄上清,加5mL PBS輕輕重懸細(xì)胞進(jìn)行潤洗,再900-1000rpm,3min離心;
Tips:此處PBS潤洗是為了去除細(xì)胞碎片,平時培養(yǎng)若細(xì)胞碎片不多可以忽略此步驟。
5. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;
6. 離心完成后棄上清,加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀,將細(xì)胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中,混勻細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
NK-92細(xì)胞傳代方法
l 離心法:
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預(yù)熱)
2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中;
3. 900-1000rpm,3min離心收集細(xì)胞;
4. 在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)
5. 離心完成后,棄離心管內(nèi)上清,然后加入適量新鮮培養(yǎng)基,輕輕重懸吹散細(xì)胞,將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
l 直接分瓶法:
1. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞均勻分散;若有較大的細(xì)胞團(tuán),需吹散成小團(tuán)。
2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液,均分到若干個新培養(yǎng)瓶中,每瓶再補(bǔ)充適量的新鮮培養(yǎng)基,輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
Tips:
l 注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉(zhuǎn)速以及時間不要過高,避免細(xì)胞受機(jī)械損傷。
l 傳代比例推薦1:2
NK-92細(xì)胞凍存方法
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、PBS、血清、DMSO、離心管以及無菌槍頭等;(試劑需提前預(yù)熱)
Tips:若凍存前培養(yǎng)基已經(jīng)變黃,先換液靜置培養(yǎng)4h左右,待細(xì)胞活力穩(wěn)定后再進(jìn)行凍存。
2. 根據(jù)收集到細(xì)胞量,配制相應(yīng)量的凍存液,并準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的凍存管,在凍存管上標(biāo)志細(xì)胞名稱,代次,凍存時間等信息。推薦凍存液配方:90%FBS+10%DMSO;凍存密度300萬細(xì)胞/mL/管。
Tips:凍存密度過低將導(dǎo)致復(fù)蘇后狀態(tài)不佳。
3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm,3min離心收集細(xì)胞;
4. 離心完成后棄上清,加入相應(yīng)量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細(xì)胞,將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度,不要產(chǎn)生過多氣泡;
Tips:加入凍存液混勻細(xì)胞后及時分裝并將細(xì)胞降溫凍存,以減少DMSO對細(xì)胞的毒性。
5. 將細(xì)胞放置程序降溫凍存盒中,再將凍存盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行降溫凍存。
6. 次日(16h-24h后)復(fù)蘇一管檢查凍存效果,確認(rèn)沒問題后及時將凍存細(xì)胞放置液氮中保存,細(xì)胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。
NK-92細(xì)胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;
2. 將凍存細(xì)胞從液氮或-80℃冰箱中取出,迅速置于37℃水浴,快速搖晃至完*融化,融化時間不超過2min;
l 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。
l 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。
3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心,同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;
4. 離心完成后棄上清,吸取1mL新鮮培養(yǎng)基(建議血清濃度提高至20%)輕輕重懸細(xì)胞,吹散細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中;
5. 使用十字法或8字法將細(xì)胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
Tips:整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
NK-92細(xì)胞收貨攻略
1. 拆封包裝盒,確認(rèn)細(xì)胞,說明書等是否齊全,收貨細(xì)胞名與所購買細(xì)胞是否符合;
2. 觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好,有無漏液,培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等,發(fā)現(xiàn)異常及時拍照聯(lián)系銷售人員;
3. 確認(rèn)無異常后,將培養(yǎng)瓶表面消毒,然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右,讓懸浮細(xì)胞沉下培養(yǎng)瓶底部;
4. 平衡過程中可以仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書,知悉細(xì)胞所需培養(yǎng)體系,培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項(xiàng)等;
5. 平衡完成后豎立取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶,此時大部分細(xì)胞沉在培養(yǎng)瓶底部,小心吸取上清至離心管中,保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi),小心操作,盡量不要吸到沉在底部的細(xì)胞;
6. 將離心管1200rpm,5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞,上清可以4℃保存,后續(xù)用于培養(yǎng)細(xì)胞,以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細(xì)胞接種至原培養(yǎng)瓶;
7. 觀察細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞狀態(tài),以及團(tuán)塊數(shù)量、大小決定傳代或繼續(xù)培養(yǎng)。
常見問題及解決方案
培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可通過900-1000rpm,3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細(xì)胞生長,不建議頻繁離心。
產(chǎn)品推薦:
【SNL-405】 NK-92(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞)(STR鑒定正確)
【SNLM-405】NK-92細(xì)胞專用完*培養(yǎng)基
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