小伙伴們在給貼壁細(xì)胞傳代的時候有沒有遇到細(xì)胞消化不下來的情況呢？有時候等了10分鐘甚至20分鐘細(xì)胞仍巋然不動，繼續(xù)等待怕消化過度，暴力吹下又怕對細(xì)胞造成機械損傷，可謂進(jìn)退兩難。

小尚為大家總結(jié)了細(xì)胞難消化的原因，以及對應(yīng)的處理方式：

（本文僅針對胰蛋白酶，若您使用其他類型的細(xì)胞解離試劑，可以在評論區(qū)留言）

1. 細(xì)胞貼壁緊

不同種類的細(xì)胞貼壁的松緊程度是不一樣的，比如293系列細(xì)胞貼壁很松，是晃一晃就可能掉下來的程度。而MCF10A細(xì)胞卻貼壁很緊，可能需要消化5-10min甚至更久才能脫落。在培養(yǎng)一株細(xì)胞之前，可以問問有經(jīng)驗的師哥師姐或者上網(wǎng)查資料確認(rèn)這株細(xì)胞大概消化多久，做到知己知彼百戰(zhàn)百勝。

解決方案：若您培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁較緊，可以增加消化時間或胰酶的濃度；加入足量的胰酶至沒過細(xì)胞；37℃消化；使用含有EDTA的胰酶。

小技巧：

在消化貼壁較緊的細(xì)胞有個小技巧，就是消化到細(xì)胞要脫落的時候先不終止，先吸胰酶輕輕吹下細(xì)胞，大部分細(xì)胞脫落后再加終止液。貼壁太強的細(xì)胞，先加終止有時候會很快貼壁回去導(dǎo)致消化其實細(xì)胞已經(jīng)要脫落了，但一加終止液就貼回去的情況。

2. 有殘留血清

血清中的某些蛋白質(zhì)（如α1-抗胰蛋白酶，α2-巨球蛋白）對蛋白酶有強烈的抑制作用。如果PBS清洗不徹*，胰酶將不能發(fā)揮作用。

解決方案：若在消化途中發(fā)現(xiàn)因潤洗不徹*而無法消化下來，吸去培養(yǎng)器皿中的胰酶（如果已有部分細(xì)胞脫落，將已脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管），向培養(yǎng)器皿中加入足量PBS重新潤洗30s，棄去PBS再加入新的胰酶重新消化。

3. 胰酶量過少/濃度低/消化溫度低

有的小伙伴習(xí)慣用胰酶潤洗細(xì)胞后去掉大部分胰酶，用剩余的胰酶繼續(xù)消化，這對于貼壁松的細(xì)胞是可以的，但該方法并不適用于貼壁緊的細(xì)胞。胰酶量太少無法將貼壁緊的細(xì)胞消化徹*。

胰酶的最適溫度是37℃，有一種常用策略是室溫消化，當(dāng)溫度低于37℃時胰酶活性低，室溫環(huán)境消化還可以放在顯微鏡下邊看邊消化，更容易把握消化進(jìn)度。但仍然需要注意這適用于貼壁較松且比較脆弱的細(xì)胞，對于貼壁緊的細(xì)胞室溫下是很難消化下來的，甚至可能因消化時間過長對細(xì)胞產(chǎn)生傷害。

常見的胰酶濃度有0.125%，0.25%和0.5%。常規(guī)細(xì)胞系多用0.25%胰酶，而對胰酶敏感的較脆弱的細(xì)胞可使用0.125%胰酶消化。應(yīng)根據(jù)細(xì)胞的貼壁特性和胰酶耐受程度，使用不同濃度的胰酶。

解決方案：根據(jù)細(xì)胞貼壁特性選擇合適的胰酶使用量、濃度和消化溫度。

4. 胰酶失活

胰酶開封久了活性會降低甚至徹*失活，所以小伙伴們可以根據(jù)需要將開封的胰酶分裝到離心管中，將暫時不用的部分放在-20℃冰箱冷凍，放在2-8℃冷藏的胰酶也要盡早使用完畢哦。

解決方案：若發(fā)現(xiàn)胰酶開封太久，建議使用新的胰酶進(jìn)行消化。

5. 胰酶品牌差異

胰酶通常來自牛或豬的胰腺，不同廠家的提取加工工藝不同，所生產(chǎn)的胰酶消化時間差別較大。

解決方案：從不同廠家獲取胰酶試用裝，找到*適合自己細(xì)胞的胰酶品牌。

6. 細(xì)胞密度過大或長時間不傳代

細(xì)胞密度過大，造成細(xì)胞擁擠或者堆疊時細(xì)胞將變得更難消化。另外，細(xì)胞長時間培養(yǎng)不傳代也有可能使細(xì)胞貼壁變緊。

解決方案：若出現(xiàn)上述情況，可增加胰酶的用量，并適當(dāng)延長消化時間，直到細(xì)胞能夠脫落。