細(xì)胞基本信息
細(xì)胞正常生長(zhǎng)形態(tài)
細(xì)胞名稱:Hi-five(昆蟲細(xì)胞)
細(xì)胞別稱: BTI-Tn-5B1-4;BTI-TN-5B1-4; BTI-TN5B1-4; BTI-Tn5B14; BTI-Tn 5B1-4; Tn-5B1-4; Tn 5B1-4; Tn5 B1-4; Tn5B1-4; TN5B14; TnH5; High Five; High 5; High-5; High5; Hi-5; Hi5; Tn-5
細(xì)胞貨號(hào): SNL-191
生長(zhǎng)特性: 半貼壁
培養(yǎng)條件: Grace's Insect Medium(Supplemented)+10%FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境:空氣,100%;
細(xì)胞簡(jiǎn)介: Hi-five(BTI-TN-5B1-4)細(xì)胞是由武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院胡遠(yuǎn)揚(yáng)教授提交保藏。Hi-five(BTI-TN-5B1-4)細(xì)胞是一株昆蟲細(xì)胞,主要用于昆蟲病毒的擴(kuò)增、病毒與宿主細(xì)胞相互作用的研究等。
Hi-five(昆蟲細(xì)胞)特點(diǎn)
1、細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí)半貼壁生長(zhǎng),也可以使用搖瓶懸浮培養(yǎng)
靜置培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞會(huì)大量附著瓶底生長(zhǎng),呈半貼壁狀態(tài),會(huì)有少部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng);
搖瓶培養(yǎng)時(shí)可以很快適應(yīng)懸浮生長(zhǎng),呈單個(gè)或小聚團(tuán)懸浮生長(zhǎng);
2、對(duì)溫度極為敏感
細(xì)胞于26-28℃空氣培養(yǎng),需要盡量控制溫度,保證細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài);
若溫度低于26℃,細(xì)胞生長(zhǎng)速度會(huì)變慢,但恢復(fù)溫度后生長(zhǎng)速度會(huì)逐漸恢復(fù),不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生過大傷害;
若溫度28℃-30℃,細(xì)胞生長(zhǎng)嚴(yán)重受限;若溫度高于30℃,細(xì)胞將受不可逆?zhèn)?dǎo)致無法使用,即使溫度恢復(fù)也無法恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài);
同時(shí)注意使用的培養(yǎng)基、PBS及其他試劑應(yīng)復(fù)溫至室溫(最好26-28℃),盡量減少觀察細(xì)胞次數(shù)和時(shí)間;
3、細(xì)胞對(duì)吹打、氣泡等機(jī)械損傷敏感
細(xì)胞操作時(shí)若吹打力度過大、氣泡過多將嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞后續(xù)存活率降低,注意操作輕柔;
4、細(xì)胞可以適應(yīng)多種培養(yǎng)體系
該細(xì)胞多用于真核細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng),因此針對(duì)該細(xì)胞有諸多培養(yǎng)體系,例如Grace's Insect Medium、SF900 II、TNM-FH、ESF921等培養(yǎng)體系,包括含血清的培養(yǎng)體系和不含血清的培養(yǎng)體系,可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)需要選擇逐步更換為合適的培養(yǎng)體系;
5、細(xì)胞對(duì)吹打、氣泡等機(jī)械損傷敏感
細(xì)胞操作時(shí)若吹打力度過大、氣泡過多將嚴(yán)重影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞后續(xù)存活率降低,注意操作輕柔;
6、細(xì)胞凍存存活率不高
實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中,尚恩發(fā)現(xiàn)Hi-five細(xì)胞疑似表現(xiàn)出較低的凍存保存能力,凍存后活率會(huì)隨保存時(shí)間增加而逐漸下降,因此若有持續(xù)培養(yǎng)該細(xì)胞或者需要快速?gòu)?fù)蘇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需求的實(shí)驗(yàn)室建議定期復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞并重新凍存以保證細(xì)胞凍存活性不會(huì)下降至無法接受的范圍;
7、細(xì)胞貼壁培養(yǎng)后可能會(huì)伸出觸角
細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)時(shí),一周左右會(huì)有部分細(xì)胞伸出較長(zhǎng)觸角,同一個(gè)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng),有觸角的細(xì)胞可能越多,這是細(xì)胞自然現(xiàn)象,非細(xì)胞交叉污染或狀態(tài)不佳;
細(xì)胞收貨攻略
常溫細(xì)胞
1.T25瓶收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放28℃培養(yǎng)箱靜置2-4h;
2.吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(傳代比例建議1:2),若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng);
凍存細(xì)胞
1.細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存,若干冰揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;
2.凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;
3.復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作;
Tips
1.細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰揮發(fā)等異常情況時(shí),及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員;
2.該細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),一般T25瓶運(yùn)輸過程中較少出現(xiàn)大量細(xì)胞脫落并聚團(tuán)的情況,少量細(xì)胞脫落是正常狀態(tài),不影響細(xì)胞生長(zhǎng),按正常操作步驟繼續(xù)培養(yǎng)即可。
3.尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng);
細(xì)胞傳代攻略
1.輕輕拍打培養(yǎng)瓶背面,使細(xì)胞松動(dòng),吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞面使細(xì)胞脫落,少量未脫落的細(xì)胞可以留著繼續(xù)培養(yǎng);
2.收集細(xì)胞懸液,混勻細(xì)胞,900rpm離心3-5min,棄上清;
3.加3-5ml PBS重懸細(xì)胞,再次混勻細(xì)胞,900rpm離心3-5min,棄上清;
4.加新的培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞,均勻分到新的培養(yǎng)瓶里,補(bǔ)足培養(yǎng)基,將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);
Tips
1. 注意操作輕柔,盡量降低吹打力度、避免產(chǎn)生氣泡;
2. T25瓶加10-12ml培養(yǎng)基,10cm皿加12-15ml,30%密度4-5天換液一次,30-50%密度3-4天換液一次,50-80%密度2-3天換液一次,80%以上每天換液;
3. 細(xì)胞收貨后傳代建議按1:2傳代,后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度情況決定傳代比例;
4. 傳代后24h建議觀察細(xì)胞并換液一次去除死亡細(xì)胞;
細(xì)胞凍存攻略
凍存步驟
1.先將細(xì)胞按傳代步驟收集離心,至傳代步驟3,棄細(xì)胞上清,獲得細(xì)胞沉淀;
2.加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的凍存管中;
3.將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;
4.轉(zhuǎn)移細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置,液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性,若活性合格即可長(zhǎng)期保存,若低于80%建議重新凍存;
Tips
1.檢測(cè)凍存細(xì)胞活性結(jié)果未合格前,培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認(rèn)凍存合格方可視需要丟棄;
2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程;
3.T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿通??梢詢龃?-3管,10cm皿長(zhǎng)滿可以凍存3-4管;
細(xì)胞復(fù)蘇攻略
復(fù)蘇步驟
1.將所需的培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復(fù)蘇;
2.準(zhǔn)備37度溫水,將細(xì)胞從液氮罐取中出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃,融化至米粒大小冰塊,終止水??;
3.將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min,不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異;
4.離心完成后棄凍存液,用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,并輕柔重懸細(xì)胞后接種至T25或者10cm皿中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;
5.24h后觀察細(xì)胞并換液一次,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng);
Tips
1.凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大,水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮建議靜置一會(huì)待液氮蒸發(fā)后再水??;
2.水浴時(shí)可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率;
3.水浴至剩米粒大小時(shí)及時(shí)終止水浴,避免過度水浴或水浴時(shí)間不足;
4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細(xì)胞,避免再次轉(zhuǎn)移細(xì)胞;
5.復(fù)蘇后的細(xì)胞比較脆弱,吹打和轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)盡量輕柔,復(fù)蘇24h后換液去除死亡細(xì)胞;
常見問題及解決方案
1、細(xì)胞密度怎么計(jì)算的?
嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實(shí)際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式;
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時(shí)碎片比較少,傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。
NO.3懸浮培養(yǎng)需要怎么操作?
本公司Hi-five細(xì)胞自適應(yīng)懸浮培養(yǎng),基本無需訓(xùn)化。 需要懸浮培養(yǎng)前需保證細(xì)胞活性90%以上,收集細(xì)胞懸液,以1x107細(xì)胞/ml的密度接種至搖瓶中培養(yǎng)即可。搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速跟實(shí)際條件相關(guān),尚恩使用轉(zhuǎn)速約100rpm/min,客戶可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室情況選擇合適的轉(zhuǎn)速(通常80-150rpm之間)。
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