細(xì) 胞 基 本 信 息

細(xì)胞正常生長(zhǎng)形態(tài)

細(xì)胞名稱: A-375(人惡性黑色素瘤細(xì)胞)

細(xì)胞別稱: A 375; A375; A375-MEL; A375-mel; A375mel

細(xì)胞貨號(hào): SNL-065

生長(zhǎng)特性: 貼壁

培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境: 空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

細(xì)胞簡(jiǎn)介: A-375細(xì)胞源自患有惡性黑色素瘤的女性患者的皮膚，是由D·J·Giard等人建立的一系列細(xì)胞株中的一株。A-375細(xì)胞在抗胸腺細(xì)胞球蛋白、血清處理的NIH瑞士小鼠中形成類似于惡性黑素瘤的快速增長(zhǎng)的皮下腫瘤，A-375細(xì)胞可以在普通成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層和瓊脂上形成克隆。A-375細(xì)胞是NRAS mutant-A375 isogenic理想對(duì)照，可用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、高通量篩選、毒理學(xué)和免疫腫瘤學(xué)研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

A-375（人惡性黑色素瘤細(xì)胞）特點(diǎn)

01細(xì)胞顆粒感較重

細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)黑點(diǎn)及細(xì)胞外顆粒較多，建議使用優(yōu)質(zhì)血清及培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞；

02傳代、復(fù)蘇注意細(xì)胞狀態(tài)

細(xì)胞消化或者復(fù)蘇操作不當(dāng)容易導(dǎo)致細(xì)胞死亡裂解產(chǎn)生大量碎片及顆粒，進(jìn)而影響活細(xì)胞狀態(tài)，注意消化或復(fù)蘇過程盡量輕柔，嚴(yán)格控制消化時(shí)間和復(fù)蘇操作規(guī)范，傳代或復(fù)蘇24h后建議觀察細(xì)胞，建議換液一次去除死亡細(xì)胞；

細(xì) 胞 收 貨 攻 略

常溫細(xì)胞

1.T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置2-4h；

2.吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

凍存細(xì)胞

1.細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存，若干冰揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；

2.凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；

3.復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

1.細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員；

2.該細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，一般T25瓶運(yùn)輸過程中較少出現(xiàn)大量細(xì)胞脫落并聚團(tuán)的情況，少量細(xì)胞脫落是正常狀態(tài)，不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，按正常操作步驟繼續(xù)培養(yǎng)即可。

3.尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

細(xì) 胞 傳 代 攻 略

1.先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞10-20s，吸走潤(rùn)洗的PBS；

2. T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細(xì)胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；

3.消化到細(xì)胞間隙變大，但未脫落時(shí)加2-3ml培養(yǎng)基終止胰酶消化；

4.混勻細(xì)胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

5.加新的培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里，補(bǔ)足培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

Tips：

1.對(duì)于消化細(xì)胞程度，客戶如果經(jīng)驗(yàn)不多，無(wú)法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時(shí)間，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復(fù)溫到室溫后加入細(xì)胞，放入37度培養(yǎng)箱，然后每隔30秒，即吹打下細(xì)胞（此時(shí)吹打細(xì)胞應(yīng)盡量輕柔，不能強(qiáng)行將細(xì)胞吹下，否則細(xì)胞可能出現(xiàn)機(jī)械損傷），如果能夠吹打散細(xì)胞，說明細(xì)胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復(fù)操作直至能夠輕柔的吹下細(xì)胞；

2. T25瓶加10-12ml培養(yǎng)基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。

3. 細(xì)胞收貨后傳代建議按1：2傳代，后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；

傳代后24h建議觀察細(xì)胞并換液一次去除死亡細(xì)胞；

細(xì)胞 凍 存 攻 略

凍存步驟

1.先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細(xì)胞上清，獲得細(xì)胞沉淀；

2.加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的凍存管中；

3.將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

4.轉(zhuǎn)移細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置，液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長(zhǎng)期保存，若低于80%建議重新凍存；

Tips：

1.檢測(cè)凍存細(xì)胞活性結(jié)果未合格前，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認(rèn)凍存合格方可視需要丟棄；

2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程；

3.T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿通?？梢詢龃?-3管，10cm皿長(zhǎng)滿可以凍存3-4管；

細(xì) 胞 復(fù) 蘇 攻 略

復(fù)蘇步驟

1.將所需的培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復(fù)蘇；

2.準(zhǔn)備37度溫水，將細(xì)胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無(wú)液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水??；

3.將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異；

4.離心完成后，棄凍存液，用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細(xì)胞后接種至T25或者10cm皿中。

Tips：

1.凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會(huì)待液氮蒸發(fā)后再水浴；

2.水浴時(shí)可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率；

3.水浴至剩米粒大小時(shí)及時(shí)終止水浴，避免過度水浴或水浴時(shí)間不足；

4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細(xì)胞，避免再次轉(zhuǎn)移細(xì)胞；

5.復(fù)蘇后的細(xì)胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)盡量輕柔，復(fù)蘇24h后換液去除死亡細(xì)胞；

常見問題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計(jì)算的？

嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式；

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2.細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久？

每個(gè)客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能規(guī)定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。 

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