小鼠心肌細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)
更新時(shí)間:2021-10-20瀏覽:594次
小鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法,可評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞的存活狀況并鑒定心肌細(xì)胞純度。方法應(yīng)用胰酶聯(lián)合膠原酶共同消化3d內(nèi)C57乳小鼠心臟,臺(tái)盼藍(lán)染色判斷心肌細(xì)胞存活率,α-actin免疫熒光染色鑒定心肌細(xì)胞純度。結(jié)果利用3d內(nèi)乳鼠心臟可成功培養(yǎng)原代小鼠心肌細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞存活率大于95%,α-actin免疫熒光染色顯示心肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上。結(jié)論嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件,可成功培養(yǎng)高存活率和高純度的小鼠心肌細(xì)胞。
小鼠心肌細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng):
心肌組織的分離:取出生0~3d的乳小鼠20只,浸泡于75%的酒精中8~10s消毒后迅速送入超凈工作臺(tái),將其固定于無(wú)菌泡沫板上,用眼科剪將乳小鼠胸骨正中偏左的皮膚剪開(kāi),用鑷子分離皮膚,充分暴露胸部,換另一把眼科剪做一縱向切口打開(kāi)胸腔,盡量不要超出剪開(kāi)的皮膚范圍,忌打開(kāi)腹腔,以免引起污染,根據(jù)心臟的搏動(dòng),順勢(shì)將心臟擠出。
取心臟放入冰冷的PBS緩沖液中吹打清洗,盡量將紅細(xì)胞清洗干凈,用眼科鑷輔助眼科剪將多余的心房及周?chē)谓M織等去除,隨后將心臟移到另一個(gè)干凈的培養(yǎng)皿,將心臟剪裂2~3下(裂而不斷的程度即可),共清洗3遍。
心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng):將心臟組織吸入玻璃培養(yǎng)瓶中,加入0.25%胰酶(含EDTA)10mL,靜置,4°C過(guò)夜(12~16h)。第2天,取出過(guò)夜的心臟組織,加入*培養(yǎng)液10mL,37°C恒溫水浴5min,中止胰酶的消化作用;棄去上清液,加入膠原消化液10mL(注意棄上清液時(shí)勿把心臟組織吸走)。置于37°C的恒溫水浴箱,1min用手輕搖。棄上清液,將心臟組織移入另一個(gè)培養(yǎng)瓶中加入12mL膠原消化液,置于37°C恒溫水浴箱上,用手輕搖30min,將上清液移入新的離心管中。重復(fù)消化3~4次,僅見(jiàn)絮狀樣物質(zhì)即心肌組織消化*。
將收集的上清液離心1000r/min5min,棄上清液,加*培養(yǎng)液30mL,輕輕拍打管壁使得細(xì)胞懸浮于其中,隨后接種在100mm培養(yǎng)皿中,放于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育70min,差速貼壁以除去成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等非心肌細(xì)胞。輕輕吸出細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染液染色計(jì)數(shù),根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠?培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,加入BrdU使其在培養(yǎng)液的終濃度為0.1mmol/L,輕輕混勻后,將其接種到在事先用多聚賴(lài)氨酸預(yù)包被處理過(guò)的6孔板中,37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h后,換無(wú)BrdU的*培養(yǎng)基,以后每隔48h換液1次。