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細(xì)胞攻略 |J774A.1(小鼠單核巨噬細(xì)胞)培養(yǎng)教程

更新時(shí)間:2024-05-20瀏覽:906次

--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱 J774A.1(小鼠單核巨噬細(xì)胞)

細(xì)胞別稱 J-774A.1; J774.A1; J774 A1; J774A.1; J 774A.1; J774 A.1

細(xì)胞貨號(hào) SNL-333

生長(zhǎng)特性 半貼壁細(xì)胞

培養(yǎng)條件 DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境 空氣,95%; 二氧化碳 (CO2),5%;37

細(xì)胞簡(jiǎn)介 J774A.1細(xì)胞是1968年從患有網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤的成年雌性 BALB/cN小鼠腹水中分離的。J774A.1細(xì)胞有抗體依賴的吞噬作用,生長(zhǎng)受硫酸葡聚糖、PPD和LPS的抑制。J774A.1細(xì)胞可產(chǎn)生IL-1β和大量的溶菌酶。

 


細(xì)胞正常生長(zhǎng)形態(tài)照片

 J774A.1 40.jpgJ774A.1 100.jpg



J774A.1細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

 

1. 細(xì)胞半貼壁圓形或多角形生長(zhǎng),部分懸浮圓形,傳代時(shí)均可收集培養(yǎng),換液時(shí)將懸浮細(xì)胞離心收集后重新接回原瓶,若貼壁細(xì)胞較多活性較好時(shí)可以不要懸浮的細(xì)胞。

 

2. J774A.1細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶敏感接觸胰酶后將發(fā)生自發(fā)分化,貼壁變緊,很難消化下來(lái)。所以不建議用胰酶對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行傳代。(詳細(xì)傳代步驟見(jiàn)下文)

 

3. J774A.1細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快,消耗營(yíng)養(yǎng)也較快。建議每天觀察細(xì)胞密度,當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)80%時(shí)及時(shí)進(jìn)行傳代,以防細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)狀態(tài)變差。密切關(guān)注培養(yǎng)基顏色,當(dāng)培養(yǎng)基有變黃趨勢(shì)時(shí)及時(shí)換液,以防營(yíng)養(yǎng)不夠?qū)е录?xì)胞狀態(tài)變差。

 

 

J774A.1細(xì)胞傳代方法

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無(wú)菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)

2. 輕輕吸走培養(yǎng)上清,留 2-3mL 培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞面吹下細(xì)胞;

2. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管,900rpm 離心 3-5min,棄上清;

3. 加新的完quan培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞,均勻分到新的培養(yǎng)瓶里;

4. 補(bǔ)足完quan培養(yǎng)基,將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

Tips:

1. 吹打次數(shù)不宜過(guò)多,吹打力度保持輕柔,以免機(jī)械刺激造成細(xì)胞自分化或損傷。

2. 推薦使用1mL吸頭進(jìn)行吹打

 

J774A.1細(xì)胞凍存方法

1. 配制程序性凍存液,準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量?jī)龃婀懿⒆龊脴?biāo)記。

Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細(xì)胞按傳代步驟獲得細(xì)胞沉淀;

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中;

4. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過(guò)夜;

5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置。

Tips:

液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性,若活性合格即可長(zhǎng)期保存。

程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請(qǐng)按產(chǎn)品說(shuō)明書處理降溫過(guò)程。

T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿通??蓛龃?-3管,10cm皿長(zhǎng)滿通??蓛龃?-4管。

凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。

 

J774A.1細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;

2. 將細(xì)胞從液氮罐中取出,觀察管內(nèi)無(wú)液氮的情況下,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴,融化過(guò)程不超過(guò)2min;

Tips:

若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。

凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮需靜置一會(huì)待液氮完quan蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù),避免凍存管炸開(kāi)導(dǎo)致受傷。

水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。

 

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異

4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;

5. 復(fù)蘇24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips:整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

 

J774A.1細(xì)胞收貨攻略

常溫細(xì)胞

1. 收貨后,拆開(kāi)外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(首ci傳代比例建議1:2),若細(xì)胞密度低于70%可以10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng);

Tips:若收貨時(shí)發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多,應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶

凍存細(xì)胞

1. 細(xì)胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存,若干冰完quan揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;

2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;

3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作;

Tips:

1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完quan揮發(fā)等異常情況時(shí),及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員;

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完quan培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng);

 

 

 

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計(jì)算的?

嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。

 

NO.2培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性,無(wú)法清除也無(wú)法改變,大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完quan培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用完quan培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時(shí)碎片比較少,傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。

 

 

產(chǎn)品推薦:

SNL-333J774A.1 (小鼠單核巨噬細(xì)胞)

SNLM-333】J774A.1細(xì)胞專用完quan培養(yǎng)基

 

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