非洲綠猴腎細(xì)胞是從正常成年非洲綠猴的腎臟組織中分離建立的。該細(xì)胞常作為轉(zhuǎn)染宿主,用于支原體的檢測(cè)。細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至狀態(tài)良好后灌滿培養(yǎng)基運(yùn)輸,獲得細(xì)胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒,然后在超凈臺(tái)中操作;如細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%,將瓶中的培養(yǎng)基移入無(wú)菌瓶中留作培養(yǎng)使用,保留5-8mL培養(yǎng)基在37℃、5%的CO2的溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至90%-100%后,按要求消化傳代;棄去培養(yǎng)基,用無(wú)菌PBS或者其他緩沖液清洗細(xì)胞2次,加入適量胰蛋白酶消化(EDTA胰酶),待細(xì)胞*脫壁后加培養(yǎng)基吹打混勻,分瓶培養(yǎng)。
非洲綠猴腎細(xì)胞Vero可能作為表達(dá)外源蛋白質(zhì)的有用細(xì)胞。作為一種連續(xù)傳代的靈長(zhǎng)類細(xì)胞,Vero細(xì)胞的糖基化酶可能與人類的相似。Vero細(xì)胞可以大規(guī)模培養(yǎng),已經(jīng)用于脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的生產(chǎn)。研究了不同條件下Vero細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,包括脂質(zhì)體和DNA的濃度,細(xì)胞數(shù)量以及細(xì)胞暴露于脂質(zhì)體-DNA混合物中的時(shí)間。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因β-gal確定轉(zhuǎn)染效率,優(yōu)化不同轉(zhuǎn)染參數(shù),提高了Vero細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率和表達(dá)水平。
非洲綠猴腎細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳染的步驟:
?。?)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,以2.5~7.5×10°細(xì)胞/孔接種細(xì)胞于0.5ml適當(dāng)*培養(yǎng)基中。
?。?)37℃過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)胞,直到細(xì)胞生長(zhǎng)至50~80%匯和。
?。?)在滅菌的Eppendorf管中準(zhǔn)備下列溶液
溶液A:用25u1無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋0.25~0.5ug pCDNA3LacZ。
溶液B:用25ul無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋0.5~6.25ul lipofectAMINE試劑。
?。?)溫和混合兩溶液,室溫放置15~45分鐘以利于DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的形成,與此同時(shí),用0.5ml無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞一次。
?。?)混合物中加入0.2ml無(wú)血清培養(yǎng)基,溫和混合,加入到漂洗過(guò)的細(xì)胞中。
(6)37℃二氧化碳溫箱溫育2~24小時(shí)。
?。?)溫育結(jié)束后,不清除轉(zhuǎn)染混合物直接加入含兩倍濃度血清的培養(yǎng)基。
(8)轉(zhuǎn)染18~24小時(shí)后,換以新鮮的*培養(yǎng)基。
?。?)48小時(shí)后,收獲細(xì)胞或開(kāi)始篩選。