小鼠原代細胞是從小鼠的特定組織中提取出來的,則可直接得到目的基因不表達的原代細胞模型,且與我們在KO小鼠上的研究具有更好的承接性,從而讓我們想要證實的實驗?zāi)康母哂姓f服性。KO小鼠的原代細胞還可用于細胞水平的藥物篩選、藥物評價等方面。原代細胞(Primary cells)是指來源活體組織,經(jīng)特定分離方法制備而成的初始細胞。原代細胞離體時間短且不經(jīng)過永生化過程,其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,仍保持原有的遺傳特征,可更好地反映細胞在體內(nèi)的生長狀態(tài),從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)。
小鼠原代細胞分離實驗步驟:
1、小鼠麻醉
根據(jù)體重計算相應(yīng)的麻醉劑量并腹腔注射(也可以用異氟烷進行空氣麻醉)
2、對*麻醉后的小鼠進行解剖,打開腹腔,找到小鼠下腔靜脈及門靜脈,使用滯留針插入下腔靜脈,將50-60ml的緩沖溶液一在10-20min內(nèi)緩慢注射進入小鼠血液循環(huán)內(nèi),看到小鼠肝臟有明顯腫脹時剪開門靜脈,完成后改用緩沖溶液二進行沖洗。
3、沖洗完成后,將小鼠肝臟剪下,轉(zhuǎn)移至DMEM高糖培養(yǎng)基,用DMEM培養(yǎng)基清洗2-3次后,使用滅菌鑷子將肝臟在培養(yǎng)基內(nèi)撕開,使原代肝細胞從肝臟內(nèi)流出。
4、將分離得到的肝臟細胞過篩網(wǎng)篩選,過濾組織碎塊及其他雜質(zhì),并對細胞混懸液離心,按照一定的離心力得到初步的肝細胞沉淀,此時的肝細胞中混雜著肝臟實質(zhì)細胞和非實質(zhì)細胞,需要使用percoll離心液進行梯度離心。
5、梯度離心后的細胞即為原代肝臟實質(zhì)細胞,重懸后計數(shù)即可用于后續(xù)的實驗,若對細胞純度存疑,也可以進行流式測定。