細胞名稱: VCaP(人前列腺癌細胞)
細胞別稱: VCaP; VCaP; VertebralCanceroftheProstate
細胞貨號: SNL-468
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 37℃;5% CO2;飽和濕度
細胞簡介: VCaP細胞是于1997年從一位不受激素影響的59歲的白人男性前列腺癌患者脊椎轉(zhuǎn)移灶中建立的。VCaP細胞先在小鼠中進行異種移植傳代,隨后進行體外培養(yǎng),體內(nèi)及體外VCaP細胞都對雄性激素敏感。最近研究發(fā)現(xiàn),VCaP細胞產(chǎn)生小鼠異種逆轉(zhuǎn)錄病毒Bxv-1,該病毒很可能是細胞在小鼠異種移植過程中獲得的。VCaP細胞是一種生長非常緩慢的細胞系,在解凍后和繼代培養(yǎng)后可能需要長達48小時才能附著。細胞通常需要至少2周或更長的時間才能達到約50%的融合,并始終存在粘附細胞、漂浮簇和中度至重度碎片的密集混合物。與T75瓶相比,T-25瓶中的細胞可以更好地恢復(fù)。不要丟棄培養(yǎng)基更換和傳代培養(yǎng)過程中可能存在的任何漂浮細胞,使用溫和的離心操作收集起來,并將其接種回原瓶。VCaP細胞以緊密形成的小簇和一些單個細胞附著,當(dāng)細胞附著并開始增殖和擴散時,它們將生長為扁平的上皮樣細胞島,緊密堆積。VCaP細胞表達CK18、P53抗原、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、Rb蛋白。VCaP細胞可以用于3D細胞培養(yǎng)和癌癥研究。
細胞正常生長形態(tài)照片
VCaP細胞培養(yǎng)注意事項:
1. 貼壁較慢
傳代或復(fù)蘇之后,VCaP細胞需要48小時左右才能完quan貼壁。建議將細胞接種至培養(yǎng)器皿后,放進培養(yǎng)箱耐心等待48小時再拿出培養(yǎng)瓶觀察,更有利于細胞貼壁。
2. 細胞生長較慢
細胞通常需要至少2周或更長的時間才能達到約50%的融合,并始終存在粘附細胞、漂浮簇和中度至重度碎片的密集混合物。接種密度不可過低,建議每次傳代為1:2 。
3. 存在漂浮細胞
不要丟棄培養(yǎng)基更換和傳代培養(yǎng)過程中可能存在的任何漂浮細胞,使用溫和的離心操作收集起來,并將其接種回原瓶。
4. 黑點較多
VCaP細胞培養(yǎng)時背景中可能有較多黑點,為細胞代謝產(chǎn)物和細胞碎片,不影響細胞生長。若黑點較多可以在換液時用預(yù)熱的PBS輕輕潤洗。
VCaP細胞傳代攻略
1. 準備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)
2. 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基,再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s,吸走潤洗的PBS;
3. T25瓶加1mL 0.25%胰酶(含EDTA),輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層,將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化;
4. 消化到細胞明顯回縮,間隙變大,但未完quan脫落時加2-3mL完quan培養(yǎng)基終止胰酶消化;
5. 混勻細胞并轉(zhuǎn)移至離心管中,1000rpm離心3min;
6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)
7. 離心完成后,棄上清,加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細胞,將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,接種后在顯微鏡下確認細胞分散為單個細胞,十字法或8字法混勻,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),注意培養(yǎng)瓶蓋透氣。
Tips:
1. 推薦傳代比例1:2,細胞生長至80%密度時即可傳代。
2. 控制吹打力度輕柔,吹打次數(shù)不能過多(建議每次重懸吹打不超過10次)
VCaP細胞凍存攻略
1. 配制程序性凍存液,準備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標記。
Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養(yǎng)基+8%DMSO
2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀;
3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞,并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中;
4. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;
5. 轉(zhuǎn)移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置。
Tips:
l 液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細胞的活性,若活性合格即可長期保存。
l 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
l T25培養(yǎng)瓶長滿通常可凍存2-3管,10cm皿長滿通??蓛龃?-4管。
l 凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細胞狀態(tài)不佳。
VCaP細胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機設(shè)置好轉(zhuǎn)速;
2. 將細胞從液氮罐中取出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴,融化過程不超過2min;
Tips:
l 若液氮或冰箱距離細胞房較遠,細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。
l 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮需靜置一會待液氮完quan蒸發(fā)后再水浴。做好防護,避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。
l 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。
3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異
4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;
5. 復(fù)蘇24小時后觀察細胞貼壁情況。
Tips:整個細胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
VCaP細胞收貨攻略
l 常溫細胞
1. 收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;
2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片,觀察細胞密度,若細胞密度大于80%即可按比例傳代(首ci傳代比例建議1:2),若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng);
Tips:若收貨時發(fā)現(xiàn)懸浮細胞較多,應(yīng)離心收集懸浮細胞并放回原瓶
l 凍存細胞
1. 細胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長期保存,若干冰完ci揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決;
2. 凍存細胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;
3. 復(fù)蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作;
Tips:
1. 細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完quan揮發(fā)等異常情況時,及時拍照聯(lián)系銷售人員;
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的完quan培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng);
常見問題及解決方案
細胞密度怎么計算的?
嚴格意義上,細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量,但在實際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此,常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值,貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴謹,但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式;
NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理?
1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光,這個屬于細胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別,細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞,消化完成后加完quan培養(yǎng)基終止消化,混勻細胞,收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細胞,再離心后,用完quan培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時碎片比較少,傳代時可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。
NO.3細胞具體消化時間是多久?
每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的,不能完quan規(guī)定消化時間,以實際消化效果和客戶經(jīng)驗為準。
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