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細(xì)胞攻略 | Kasumi-1(人急性原粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)培養(yǎng)教程

更新時間:2024-05-28瀏覽:581次

--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱 Kasumi-1(人急性原粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)

細(xì)胞別稱 Kasumi-1; Kasumi 1; KASUMI1; Kasumi1

細(xì)胞貨號 SNL-339

生長特性 懸浮

培養(yǎng)條件 1640+20% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境 空氣,95%; 二氧化碳 (CO2),5%;37

細(xì)胞簡介 Kasumi-1細(xì)胞從一名亞洲男性急性髓系白血病患者的外周血中分離出的成髓細(xì)胞,髓過氧化物酶陽性,顯示其髓性成熟的形態(tài)。Kasumi-1細(xì)胞是一個帶有8:21號染色體轉(zhuǎn)位的白血病細(xì)胞株,這個轉(zhuǎn)位使得AML1基因和ETO(或稱MTG8)基因串聯(lián),使融合基因AML1-ETO(也稱作AML1-MTG或RUNX1-CBF2T1)的表達(dá)升高,因而細(xì)胞產(chǎn)生嵌合的AML1-ETO蛋白,這個蛋白下調(diào)CEBPA mRNA、蛋白和DNA的結(jié)合活性,而這種結(jié)合對粒性白細(xì)胞的分化是極duan重要的。Kasumi-1細(xì)胞增殖實驗顯示,培養(yǎng)的Kasumi-1細(xì)胞對IL-3、IL-6、G-CSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)有響應(yīng),但對IL-1和IL-5沒有響應(yīng)。在體外液體培養(yǎng)中分別加入二甲亞砜、G-CSF、IL-5,也沒有觀察到粒性或嗜酸性細(xì)胞的成熟。Kasumi-1細(xì)胞培養(yǎng)過程中,加入佛波酯可以誘導(dǎo)出的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞。Kasumi-1細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、免疫系統(tǒng)紊亂研究、免疫學(xué)研究。

 

細(xì)胞正常生長形態(tài)照片

 

 KASUMI-1 40.jpgKASUMI-1 100.jpg


 

Kasumi-1細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

Kasumi-1細(xì)胞呈懸浮圓形生長或聚團(tuán)生長。

圓形透亮、細(xì)胞膜完整的細(xì)胞是活細(xì)胞,如果無法判斷,可以取少量細(xì)胞用臺盼藍(lán)染色后計數(shù)確定細(xì)胞活率。

接種密度建議在50萬細(xì)胞/mL左右為宜,密度過低或過高都可能造成細(xì)胞狀態(tài)變差;培養(yǎng)至80萬細(xì)胞/mL密度時即可傳代,推薦傳代比例1:2。

培養(yǎng)時存在部分細(xì)胞碎片是正?,F(xiàn)象, 若碎片比較多,可以待細(xì)胞密度較大時通過低速離心(900rpm,3min)去除部分碎片; 若碎片不多,則無需特殊處理;細(xì)胞密度低時不要離心去碎片,應(yīng)該等細(xì)胞增殖到可以傳代的密度再離心。

Kasumi-1細(xì)胞生長速度較慢,需耐心培養(yǎng)。培養(yǎng)體系中血清含量為20%,不建議降低血清比例。生長環(huán)境保持穩(wěn)定,少觀察,少操作。

當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)較差時,不建議對細(xì)胞進(jìn)行離心,需換液時可采用半換液法(詳細(xì)步驟見下文)。

Kasumi-1細(xì)胞凍存難度較大,建議使用高血清比例凍存液配方凍存細(xì)胞,凍存密度不可過低,推薦200-300萬細(xì)胞/mL/管,以提高復(fù)蘇活率。

 

 

 

Kasumi-1細(xì)胞換液方法

 

 

半換液法:

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預(yù)熱)

2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置10min,待細(xì)胞沉底;(肉眼觀察細(xì)胞沉底情況)

3. 小心吸出一半的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移到離心管;

4. 900-1000rpm 3min離心,離心管里若有細(xì)胞,則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶;

5. 原瓶補充一半的新鮮培養(yǎng)基,混勻細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

 

離心換液法:

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預(yù)熱)

2. 將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中;

3. 900-1000rpm,3min離心;

4. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)

5. 離心完成后棄上清,加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀,將細(xì)胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中,混勻細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)

 

Kasumi-1細(xì)胞傳代方法

離心法:

1.取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確定細(xì)胞密度,密度80萬/mL以上傳代,并根據(jù)計數(shù)結(jié)果確定傳代比例;

2.準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預(yù)熱)

3.用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中;

4.900-1000rpm,3min離心收集細(xì)胞;

5.在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)

6.離心完成后,棄離心管內(nèi)上清,然后加入適量新鮮培養(yǎng)基,輕輕重懸吹散細(xì)胞,將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips:懸浮細(xì)胞通常都偏脆弱,注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉(zhuǎn)速以及時間不要過高,避免細(xì)胞受機(jī)械損傷

直接分瓶法:

1. 取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確定細(xì)胞密度,密度80萬/mL以上傳代,并根據(jù)計數(shù)結(jié)果確定傳代比例;

2. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞均勻分散;

3. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液,均分到若干個新培養(yǎng)瓶中,每瓶再補充適量的新鮮培養(yǎng)基,輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

 

 

Kasumi-1細(xì)胞凍存方法

1. 取少量細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)確認(rèn)細(xì)胞密度。

Tips:若凍存前培養(yǎng)基已經(jīng)變黃,先換液靜置培養(yǎng)4h左右,待細(xì)胞活力穩(wěn)定后再進(jìn)行凍存。

2. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、PBS、血清、DMSO、離心管以及無菌槍頭等;(試劑需提前預(yù)熱)

3. 根據(jù)收集到細(xì)胞量,配制相應(yīng)量的凍存液,并準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的凍存管,在凍存管上標(biāo)志細(xì)胞名稱,代次,凍存時間等信息。推薦凍存液配方:92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養(yǎng)基+8%DMSO;凍存密度200-300萬細(xì)胞/mL/管。

Tips:凍存密度過低將導(dǎo)致復(fù)蘇后狀態(tài)不佳。

4. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm,3min離心收集細(xì)胞;

5. 離心完成后棄上清,加入相應(yīng)量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細(xì)胞,將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度,不要產(chǎn)生過多氣泡;

Tips:加入凍存液混勻細(xì)胞后及時分裝并將細(xì)胞降溫凍存,以減少DMSO對細(xì)胞的毒性。

6. 將細(xì)胞放置程序降溫凍存盒中,再將凍存盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行降溫凍存。

7. 次日復(fù)蘇一管檢查凍存效果,確認(rèn)沒問題后及時將凍存細(xì)胞放置液氮中保存,細(xì)胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。

 

Kasumi-1細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;

2. 將凍存細(xì)胞從液氮或-80℃冰箱中取出,迅速置于37℃水浴,快速搖晃至完quan融化,融化時間1min左右;

3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心,同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;

4. 離心完成后棄上清,吸取1mL新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞,吹散細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中;

5. 使用十字法或8字法將細(xì)胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

Tips:

1. 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運送至細(xì)胞房。

2. 細(xì)胞融化后需盡快離心去除DMSO。

3. 整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

 

Kasumi-1細(xì)胞收貨攻略

1. 拆封包裝盒,確認(rèn)細(xì)胞,說明書等是否齊全,收貨細(xì)胞名與所購買細(xì)胞是否符合;

2. 觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好,有無漏液,培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等,發(fā)現(xiàn)異常及時拍照聯(lián)系銷售人員;

3. 確認(rèn)無異常后,將培養(yǎng)瓶表面消毒,然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右,讓懸浮細(xì)胞沉下培養(yǎng)瓶底部;

4. 平衡過程中可以仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書,知悉細(xì)胞所需培養(yǎng)體系,培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項等;

5. 平衡完成后豎立取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶,此時大部分細(xì)胞沉在培養(yǎng)瓶底部,小心吸取上清至離心管中,保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi),小心操作,盡量不要吸到沉在底部的細(xì)胞;

6. 將離心管1200rpm,5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞,上清可以4℃保存,后續(xù)用于培養(yǎng)細(xì)胞,以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細(xì)胞接種至原培養(yǎng)瓶;

7. 輕輕混勻細(xì)胞,取100-200ul細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù),根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)密度。然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

 

常見問題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計算的?

嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而計數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。

 

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可通過900-1000rpm,3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細(xì)胞生長,不建議頻繁離心。

 

產(chǎn)品推薦:

SNL-339】 Kasumi-1(人急性原粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)

SNLM-339】Kasumi-1細(xì)胞專用完quan培養(yǎng)基


 

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