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細胞攻略 | NK-92MI(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞)培養(yǎng)教程

更新時間:2023-12-18瀏覽:1205次

--細 胞 基 本 信 息---

細胞名稱 NK-92MI(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞)

細胞別稱 NK-92MI MI; NK-92MI mi; NK92-MI; NK92MI; NK-92MI transfected with MFG-Hil2

細胞貨號 SNL-195

生長特性 懸浮

培養(yǎng)條件 1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境 空氣,95%; 二氧化碳 (CO2),5%;37

細胞簡介 NK-92細胞是從一位患有急進性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細胞衍生來的一株IL-2依賴型NK細胞株。NK-92MI細胞是轉(zhuǎn)染得到的源自NK-92細胞的IL-2非依賴的NK細胞株,親本細胞NK-92通過微粒體基因轉(zhuǎn)化法用逆轉(zhuǎn)錄病毒MFG-hIL-2載體攜帶的人IL-2cDNA進行轉(zhuǎn)化,可能由于載體整合到基因組DNA中,轉(zhuǎn)化是穩(wěn)定的。NK-92MI細胞細胞對很多惡性細胞有細胞毒性;鉻釋放試驗顯示它能殺死K562細胞和Daudi細胞。NK-92細胞有以下特征:CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面標記陽性;CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面標記陰性。NK-92MI細胞和NK-92CI細胞這兩個變種都包含、表達并合成hIL-2cDNA。NK-92MI細胞合成的IL-2水平比NK-92CI高,而親本細胞不合成表達。1998年9月提交到ATCC的培養(yǎng)物污染了支原體,其后代通過BM細胞周期蛋白處理21天消除支原體,處理后6周,用Hoechst染色、PCR和標準培養(yǎng)測試進行支原體檢測,結(jié)果都呈陰性。

 

細胞正常生長形態(tài)照片

NK92MI 40.jpgNK92MI 100.jpg

 

 

 

 

NK-92MI細胞培養(yǎng)注意事項

NK-92MI細胞呈聚團懸浮生長,細胞團較大時需要吹打成小團,防止團塊中間的細胞因營養(yǎng)不足而死亡。除非實驗需要,不建議經(jīng)常將細胞吹散成單個細胞,否則細胞狀態(tài)將變差;

NK-92MI細胞對血清要求高,應該使用優(yōu)質(zhì)血清進行培養(yǎng);

NK-92MI細胞對吹打等機械刺激敏感,不要吹打太多次,注意控制吹打力度輕柔;

NK-92MI細胞對溫度敏感,培養(yǎng)基、PBS需復溫至37℃再使用。

NK-92MI細胞凍存難度較大,建議使用90% FBS+10%DMSO凍存液,凍存密度推薦300萬細胞/毫升,不能過低。凍存時細胞應吹散成單細胞。

復蘇時建議將血清濃度提高至20%,待細胞可以正常聚集生長后再將血清濃度恢復至10%

NK-92MI細胞計數(shù)時算得的細胞的活率不能代表該細胞真實的狀態(tài)。因為培養(yǎng)時存在一些散在的單細胞,這些細胞活性較低,且不能完*去除,導致在計數(shù)時細胞整體活率可能不高。細胞狀態(tài)可以通過細胞能否聚團判斷:只要大部分細胞能聚團生長,細胞狀態(tài)就沒有問題。當細胞狀態(tài)不佳時,細胞無法順利聚團。

當細胞狀態(tài)不佳時,向培養(yǎng)基中按100-200U/mL補充IL-2,可有效改善。

 

 

 

NK-92MI細胞換液方法

 

半換液法:

1. 準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預熱)

2. 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時間,待細胞沉底;(肉眼觀察細胞沉底情況)

3. 吸頭緊貼液面,小心吸出一半的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移到離心管;

4. 900-1000rpm 3min離心,離心管里若有細胞,則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶;

5. 原瓶補充一半的新鮮培養(yǎng)基。

Tips:建議半換液2-3次后進行離心換液。

 

離心換液法:

1. 準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預熱)

2. 將所有細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中;

3. 900-1000rpm,3min離心;

4. 棄上清,加5mL PBS輕輕重懸細胞進行潤洗,再900-1000rpm,3min離心;

Tips:此處PBS潤洗是為了去除細胞碎片,平時培養(yǎng)若細胞碎片不多可以忽略此步驟。

5. 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;

6. 離心完成后棄上清,加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細胞沉淀,將細胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中,混勻細胞,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

 

 

NK-92MI細胞傳代方法

離心法:

1. 準備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等;(培養(yǎng)基提前預熱)

2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中;

3. 900-1000rpm,3min離心收集細胞;

4. 在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)

5. 離心完成后,棄離心管內(nèi)上清,然后加入適量新鮮培養(yǎng)基,輕輕重懸吹散細胞,將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

 

直接分瓶法:

1. 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶,使細胞均勻分散;若有較大的細胞團,需吹散成小團。

2. 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞懸液,均分到若干個新培養(yǎng)瓶中,每瓶再補充適量的新鮮培養(yǎng)基,輕輕混勻后將細胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips:

注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉(zhuǎn)速以及時間不要過高,避免細胞受機械損傷。

傳代比例推薦1:2

 

NK-92MI細胞凍存方法

1. 準備所需的培養(yǎng)基、PBS、血清、DMSO、離心管以及無菌槍頭等;(試劑需提前預熱)

Tips:若凍存前培養(yǎng)基已經(jīng)變黃,先換液靜置培養(yǎng)4h左右,待細胞活力穩(wěn)定后再進行凍存。

2. 根據(jù)收集到細胞量,配制相應量的凍存液,并準備相應數(shù)量的凍存管,在凍存管上標志細胞名稱,代次,凍存時間等信息。推薦凍存液配方:90%FBS+10%DMSO;凍存密度300萬細胞/mL/管。

Tips:凍存密度過低將導致復蘇后狀態(tài)不佳。

3. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm,3min離心收集細胞;

4. 離心完成后棄上清,加入相應量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細胞,將細胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度,不要產(chǎn)生過多氣泡;

Tips:加入凍存液混勻細胞后及時分裝并將細胞降溫凍存,以減少DMSO對細胞的毒性。

5. 將細胞放置程序降溫凍存盒中,再將凍存盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進行降溫凍存。

6. 次日(16h-24h后)復蘇一管檢查凍存效果,確認沒問題后及時將凍存細胞放置液氮中保存,細胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。

 

NK-92MI細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃,培養(yǎng)基復溫至室溫或37,離心機設置好轉(zhuǎn)速;

2. 將凍存細胞從液氮或-80℃冰箱中取出,迅速置于37℃水浴,快速搖晃至完*融化,融化時間不超過2min;

Tips:

若液氮或冰箱距離細胞房較遠,細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。

3. 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心,同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;

4. 離心完成后棄上清,吸取1mL新鮮培養(yǎng)基(建議血清濃度提高至20%)輕輕重懸細胞,吹散細胞后接種到培養(yǎng)瓶中;

5. 使用十字法或8字法將細胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Tips:整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

 

NK-92MI細胞收貨攻略

1. 拆封包裝盒,確認細胞,說明書等是否齊全,收貨細胞名與所購買細胞是否符合;

2. 觀察細胞培養(yǎng)瓶是否完好,有無漏液,培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等,發(fā)現(xiàn)異常及時拍照聯(lián)系銷售人員;

3. 確認無異常后,將培養(yǎng)瓶表面消毒,然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右,讓懸浮細胞沉下培養(yǎng)瓶底部;

4. 平衡過程中可以仔細閱讀細胞說明書,知悉細胞所需培養(yǎng)體系,培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項等;

5. 平衡完成后豎立取出細胞培養(yǎng)瓶,此時大部分細胞沉在培養(yǎng)瓶底部,小心吸取上清至離心管中,保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi),小心操作,盡量不要吸到沉在底部的細胞;

6. 將離心管1200rpm,5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細胞,上清可以4℃保存,后續(xù)用于培養(yǎng)細胞,以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細胞接種至原培養(yǎng)瓶;

7. 觀察細胞,根據(jù)細胞狀態(tài),以及團塊數(shù)量、大小決定傳代或繼續(xù)培養(yǎng)。

 

常見問題及解決方案

培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理?

1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光,這個屬于細胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別,細胞培養(yǎng)體系不適應、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物,可通過900-1000rpm,3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細胞生長,不建議頻繁離心。

 

產(chǎn)品推薦:

SNL-195NK-92MI(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者NK細胞)(STR鑒定正確)

SNLM-195NK-92MI細胞專用完*培養(yǎng)基 


 

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