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細(xì)胞攻略 | GL261(小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞)培養(yǎng)教程

更新時間:2023-10-23瀏覽:1099次

--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱 GL261(小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞)

細(xì)胞別稱 Glioma 261; GLIOMA 261; Glioma-261; GL-261

細(xì)胞貨號 SNL-174

生長特性 貼壁

培養(yǎng)條件 DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境 空氣,95%; 二氧化碳 (CO2),5%;37

細(xì)胞簡介 GL261細(xì)胞是于1939年通過將3-甲基膽蒽顱內(nèi)注射到C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)產(chǎn)生的大腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞,在20世紀(jì)90年代中期從Gl261腫瘤中建立體外生長細(xì)胞。文獻(xiàn)報道GL261細(xì)胞攜帶TP53和KRAS突變。

 

 GL261 40.jpgGL261 100.jpg

細(xì)胞正常生長形態(tài)照片

 

 

GL261細(xì)胞培養(yǎng)注意事項:

 

1. 細(xì)胞貼壁較弱

該細(xì)胞貼壁比較弱,因此在遇到運(yùn)輸?shù)蜏丶罢鹗?、室溫靜置太長時間、添加的培養(yǎng)基或其他試劑過冷等情況時會出現(xiàn)明顯的細(xì)胞回縮變粗變短甚至脫落的現(xiàn)象,及時放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)后可恢復(fù)正常。另外,該細(xì)胞消化時間偏短,注意控制消化時間。

 

2. 注意控制細(xì)胞密度

密度過高和過低都會影響細(xì)胞狀態(tài)。密度過低時,細(xì)胞生長速度減慢;長時間高密度培養(yǎng)將導(dǎo)致細(xì)胞受損。建議細(xì)胞生長至80%密度時傳代。

 

3. 細(xì)胞生長較快

注意每天觀察細(xì)胞密度,及時換液及傳代。應(yīng)注意每天傳代對細(xì)胞不利,通過控制接種密度將傳代頻率保持在2-3天傳一次為宜。

 

4. 容易聚集成團(tuán)

該細(xì)胞容易聚集成團(tuán),傳代的時候注意盡量吹散細(xì)胞。若成團(tuán)嚴(yán)重且難以解決,可嘗試其他品牌的血清,或使用多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。

 

 

GL261細(xì)胞傳代攻略

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)

2. 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基,再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細(xì)胞10-20s,吸走潤洗的PBS;

3. T25瓶加1mL胰酶,輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細(xì)胞層,將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化;

4. 消化到細(xì)胞明顯回縮,間隙變大,但未完*脫落時加2-3mL完*培養(yǎng)基終止胰酶消化;

Tips:如果您無法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時間,建議按照下述操作:胰酶首先復(fù)溫到室溫后加入細(xì)胞,放入37度培養(yǎng)箱,然后每隔30秒,即吹打1-2次細(xì)胞(此時吹打細(xì)胞應(yīng)盡量輕柔,不能強(qiáng)行將細(xì)胞吹下,否則細(xì)胞將出現(xiàn)機(jī)械損傷),如果能夠吹打散細(xì)胞,說明細(xì)胞消化完成可以終止消化,如果30秒吹打不下,再等30秒重復(fù)操作直至能夠輕柔的吹下細(xì)胞;細(xì)胞貼壁較弱,所以消化時間會比常規(guī)貼壁細(xì)胞短很多,注意控制消化時間;

5. 混勻細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中,1000rpm離心3min;

6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)

7. 離心完成后,棄上清,加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞,將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,十字法或8字法混勻,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),注意培養(yǎng)瓶蓋透氣;

 

Tips:

1. 細(xì)胞生長至80%密度時即可傳代。

2. 建議傳代后24h再觀察細(xì)胞,若有漂浮死細(xì)胞,可通過換液去除

 

GL261細(xì)胞凍存攻略

1. 配制程序性凍存液,準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記。

Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細(xì)胞按傳代步驟獲得細(xì)胞沉淀;

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中;

4. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;

5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置。

Tips:

液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性,若活性合格即可長期保存。

程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。

T25培養(yǎng)瓶長滿通常可凍存2-3管,10cm皿長滿通??蓛龃?-4管。

凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。

 

 

GL261細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;

2. 將細(xì)胞從液氮罐取中出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴,融化過程不超過2min;

Tips:

若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。

凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù),避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。

水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。

 

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會有差異

4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;

5. 復(fù)蘇24小時后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips:整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

 

GL261細(xì)胞收貨攻略

常溫細(xì)胞

1. 收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(首*傳代比例建議1:2),若細(xì)胞密度低于70%可以10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng);

Tips:若收貨時發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多,應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶

凍存細(xì)胞

1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長期保存,若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;

2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;

3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作;

Tips:

1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時,及時拍照聯(lián)系銷售人員;

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng);

 

 

常見問題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計算的?

嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實(shí)際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式;

 

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時碎片比較少,傳代時可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。

 

NO.3細(xì)胞具體消化時間是多久?

每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣,不能完*規(guī)定消化時間,以實(shí)際消化效果和客戶經(jīng)驗為準(zhǔn)。 

 

 

產(chǎn)品推薦:

SNL-174 GL261(小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞)(STR鑒定正確)

SNLM-174GL261細(xì)胞專用完*培養(yǎng)基

SNL-547 GL261+luc(小鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(luc標(biāo)記))

SNLM-547GL261+luc 小鼠膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞(luc標(biāo)記)專用培養(yǎng)基


 


 

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