細(xì)胞基本信息
▼細(xì)胞正常生長形態(tài)照片
細(xì)胞名稱: RAW 264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞)
細(xì)胞別稱: RAW264; RAW2647; RAW264.7; RAW-264.7; Raw 264.7; Raw264.7
細(xì)胞貨號: SNL-112
生長特性: 半貼壁細(xì)胞
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣,95%;二氧化碳 (CO2),5%;37℃
細(xì)胞簡介: RAW 264.7細(xì)胞是從Abelson小鼠白血病病毒(MuLV)誘導(dǎo)的腫瘤中建立的雄性小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系,Raschke等人于1976年首*報道了該細(xì)胞系。RAW 264.7細(xì)胞sIg-、Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原陰性。RAW 264.7細(xì)胞不分泌可檢測到的病毒顆粒,XC斑點(diǎn)形成試驗(yàn)陰性。根據(jù)Janet W.Hartley博士在2008年發(fā)表的一項研究,RAW 264.7細(xì)胞被證明表達(dá)生態(tài)性和多向性MuLV,并且使用XC噬斑試驗(yàn)對病毒復(fù)制呈陽性。RAW 264.7細(xì)胞可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖,并且可以抗體依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細(xì)胞。LPS或PPD處理2天可誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分解紅血球,但對腫瘤靶細(xì)胞無作用。RAW 264.7細(xì)胞易于繁殖,DNA轉(zhuǎn)染效率高,對RNA干擾敏感,并支持小鼠諾如病毒的復(fù)制,可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、免疫系統(tǒng)紊亂和免疫學(xué)研究,也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)注意事項
1. 存在少量分化細(xì)胞
RAW264.7細(xì)胞形態(tài)主要為圓形。因其對環(huán)境非常敏感,在培養(yǎng)時會出現(xiàn)少量短梭形或多角形的分化細(xì)胞,這是正常現(xiàn)象。分化的細(xì)胞貼壁牢固,而未分化的細(xì)胞貼壁松散。根據(jù)貼壁松緊差異,可將未分化的細(xì)胞吹下,并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。
2. 對胰酶敏感
RAW264.7細(xì)胞對胰蛋白酶敏感,接觸胰酶后將很快發(fā)生自發(fā)分化,貼壁變緊,很難消化下來。所以不建議用胰酶對該細(xì)胞進(jìn)行傳代。(詳細(xì)傳代步驟見下文)
3. 生長較快
RAW264.7細(xì)胞生長速度較快,建議每天觀察細(xì)胞密度,當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)80%時及時進(jìn)行傳代,以防細(xì)胞過度生長狀態(tài)變差。
RAW264.7細(xì)胞傳代方法
1.準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)
2. 輕輕吸走培養(yǎng)上清,留 2-3mL 培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞面吹下細(xì)胞;
2. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管,900rpm 離心 3-5min,棄上清;
3. 加新的完*培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞,均勻分到新的培養(yǎng)瓶里;
4. 補(bǔ)足完*培養(yǎng)基,將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
Tips:吹打次數(shù)不宜過多,吹打力度保持輕柔,以免機(jī)械刺激造成細(xì)胞自分化或損傷。
RAW264.7細(xì)胞凍存方法
1. 配制程序性凍存液,準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記。
Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO
2. 先將細(xì)胞按傳代步驟獲得細(xì)胞沉淀;
3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中;
4. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;
5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置。
Tips:
液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性,若活性合格即可長期保存。
程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
T25培養(yǎng)瓶長滿通??蓛龃?-3管,10cm皿長滿通??蓛龃?-4管。
凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。
RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;
2. 將細(xì)胞從液氮罐取中出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴,融化過程不超過2min;
Tips:
若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。
凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù),避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。
水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。
3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會有差異
4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;
5. 復(fù)蘇24小時后觀察細(xì)胞貼壁情況。
Tips:整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
RAW264.7細(xì)胞收貨方法
常溫細(xì)胞
1. 收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;
2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(首*傳代比例建議1:2),若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng);
Tips:若收貨時發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多,應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶
凍存細(xì)胞
1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長期保存,若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;
2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;
3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作;
Tips:
1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時,及時拍照聯(lián)系銷售人員;
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng);
常見問題及解決方案
細(xì)胞密度怎么計算的?
嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實(shí)際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時碎片比較少,傳代時可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。
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