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細胞攻略 | SK-BR-3(人乳腺腺癌細胞)培養(yǎng)教程

更新時間:2023-09-18瀏覽:1411次


細胞基本信息


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細胞正常生長形態(tài)照片


細胞名稱:SK-BR-3(人乳腺腺癌細胞)

細胞別稱 :SK-Br-3; Sk-Br-3; SK BR 03; SKBR-3; SKBr-3; SK-BR3; SKBr3; SkBr3; SKBR3

細胞貨號: SNL-058

生長特性 :貼壁

培養(yǎng)條件 :1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境 :空氣,95%;二氧化碳 (CO2),5%;37℃

細胞簡介:  SK-BR-3細胞是由Trempe·G和Old·L·J于1970年從一位曾接受過放射、類固醇、環(huán)磷酰胺和5-氟尿嘧啶治療的43歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離得到的。SK-BR-3細胞亞顯微結(jié)構(gòu)特征包括微絲和橋粒、肝糖原顆粒、大溶酶體、成束的細胞質(zhì)纖絲;SK-BR-3細胞過表達HER2/c-erb-2基因產(chǎn)物,不含病毒顆粒。SK-BR-3細胞可以用于3D細胞培養(yǎng)和乳腺癌研究,也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

 

 

SK-BR-3細胞培養(yǎng)注意事項

 

 


1、形態(tài)多樣

SK-BR-3細胞形態(tài)不均一,以鋪路石樣細胞為主,同時存在部分圓形細胞,兩種形態(tài)的細胞皆為貼壁狀態(tài)。


2. 生長較慢

SK-BR-3細胞生長較緩慢,在1:2傳代的條件下需要培養(yǎng)4-7天可達到80%密度。請勿頻繁換液和消化,減少觀察頻率,保證細胞生長環(huán)境穩(wěn)定。若細胞生長過慢,可以采用半換液的方式進行換液(詳細步驟見下圖),促進細胞生長。

 

 

▲半換液操作示意圖

 

 

3. 存在漂浮細胞

SK-BR-3在培養(yǎng)時存在漂浮細胞,特別是傳代和復(fù)蘇后,因部分細胞貼壁較慢,可能存在較多的漂浮細胞。因此,在傳代和復(fù)蘇后的48小時內(nèi),不建議對細胞進行任何操作,使細胞保持靜置狀態(tài),促進細胞更好地貼壁

若細胞長期存在大量的漂浮細胞,請使用臺盼藍染液檢測漂浮細胞活性。如果大部分是死細胞,需及時換液清除;如果大部分是活細胞,在換液時離心收集,并放回原瓶。

 

SK-BR-3細胞傳代方法

 

 

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)

2. 抽走培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基,加5mL PBS潤洗1-2遍,清除殘留培養(yǎng)基;3. 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶,搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底,放置培養(yǎng)箱37℃消化;

4. 消化時每隔30s拿出來觀察,鏡下可見細胞明顯回縮,輕拍培養(yǎng)瓶部分細胞開始脫落時立即加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化,吹落貼壁的細胞;

Tips:注意控制吹打力度輕柔,吹打次數(shù)不可過多,避免機械損傷

 

5. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,1000rpm,3min離心收集細胞;

6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)

7. 離心完成后,棄上清,加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細胞,將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,十字法或8字法混勻,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),注意培養(yǎng)瓶蓋透氣;

Tips:

1. 推薦傳代比例1:2,細胞生長至80%密度時傳代,密度過大時易出現(xiàn)漂浮細胞。

2. 該細胞傳代后貼壁較慢,傳代后48小時內(nèi)不應(yīng)擾動細胞。

 

 

 

SK-BR-3細胞凍存方法

 

 

1. 配制程序性凍存液,準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記。

 

Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO

 

2. 先將細胞按傳代步驟消化、離心、棄上清,獲得細胞沉淀;

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞,并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中;

4. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;

5. 轉(zhuǎn)移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置

 

Tips:

液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細胞的活性,若活性合格即可長期保存。

程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。

T25培養(yǎng)瓶長滿通??蓛龃?-3管,10cm皿長滿通??蓛龃?-4管。

凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細胞狀態(tài)不佳。

 

SK-BR-3細胞復(fù)蘇方法

 

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機設(shè)置好轉(zhuǎn)速;

2. 將細胞從液氮罐取中出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴,融化過程不超過2min;

Tips:

若液氮或冰箱距離細胞房較遠,細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護,避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。

水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。

 

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異

4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;

5. 復(fù)蘇24小時后觀察細胞貼壁情況。

 

Tips:

1. 整個細胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

2. 該細胞復(fù)蘇后貼壁較慢,復(fù)蘇后48小時內(nèi)不應(yīng)擾動細胞。

 


SK-BR-3細胞收貨攻略

 

 ?常溫細胞

1. 收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片,觀察細胞密度,若細胞密度大于80%即可按比例傳代(首*傳代比例建議1:2),若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng);

Tips:若收貨時發(fā)現(xiàn)懸浮細胞較多,應(yīng)離心收集懸浮細胞并放回原瓶



 ?凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長期保存,若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決;

2. 凍存細胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;

3. 復(fù)蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作;

 

Tips:

1. 細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時,及時拍照聯(lián)系銷售人員;

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的完*培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng);

 

 

常見問題及解決方案

 

 

 

細胞密度怎么計算的?

嚴格意義上,細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量,但在實際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此,常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值,貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴謹,但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式。

 

NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理?

1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光,這個屬于細胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別,細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞,消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,混勻細胞,收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細胞,再離心后,用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時碎片比較少,傳代時可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。

 

NO.3細胞具體消化時間是多久?

每個實驗室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的,不能完*規(guī)定消化時間,以實際消化效果和實驗經(jīng)驗為準(zhǔn)。 

 

 

產(chǎn)品推薦SUNNCELL

【SNL-058】?SK-BR-3(人乳腺腺癌細胞)

【SNLM-058】SK-BR-3細胞專用完*培養(yǎng)基

 



 

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