01細(xì) 胞 基 本 信 息
細(xì)胞名稱: Caco-2(人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞)
細(xì)胞別稱:CaCo-2; CACO-2; Caco 2; CACO 2; CACO2; CaCo2; CaCO2; Caco2; Caco-2/ATCC
細(xì)胞貨號: SNL-068
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+20% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣,95%;二氧化碳 (CO2),5%;37℃
細(xì)胞簡介: Caco-2細(xì)胞分離自一名72歲結(jié)腸腺癌白人男性患者直腸原位癌。當(dāng)長到滿時(shí),Caco-2細(xì)胞表現(xiàn)出特征性的腸上皮細(xì)胞分化。Caco-2細(xì)胞表達(dá)熱穩(wěn)定腸毒素(Sta,大腸桿菌)、表皮生長因子(EGF)、維生素A酸結(jié)合蛋白I和視黃醇結(jié)合蛋白II,并呈角質(zhì)蛋白陽性。Caco-2細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、高通量篩選、癌癥研究和毒理學(xué)研究,也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
▼細(xì)胞正常生長形態(tài)照片
02Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)
1、空泡現(xiàn)象
密集較高時(shí),Caco-2細(xì)胞中可見巨大的空泡,這是該細(xì)胞正常特性,無需擔(dān)心。
2、消化時(shí)間長
Caco-2貼壁緊,細(xì)胞間連接緊密,細(xì)胞容易成片脫落。傳代時(shí),建議分次消化(詳細(xì)步驟見下文)該細(xì)胞難以消化成單個(gè)細(xì)胞,脫落后將細(xì)胞吹打成小團(tuán)即可終止消化。
3、貼壁較慢
傳代或復(fù)蘇之后,Caco-2需要48小時(shí)左右才能完*貼壁。建議將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿后,放進(jìn)培養(yǎng)箱耐心等待48小時(shí)再拿出培養(yǎng)瓶觀察,更有利于細(xì)胞貼壁。此外還需注意血清對貼壁的影響,血清的比例低于20%時(shí),Caco-2細(xì)胞貼壁時(shí)間延長,甚至不貼壁。
4、生長緩慢
80%密度1:2傳代的前提下,Caco-2通常需要培養(yǎng)5-7天再傳代。
03Caco-2細(xì)胞傳代方法
1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等;(試劑提前預(yù)熱)
2. 抽走培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基,加5mL PBS潤洗1-2遍,清除殘留培養(yǎng)基;
3. 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶,搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底,放置培養(yǎng)箱37℃消化;
4. 消化時(shí),每隔3-5min拿出來觀察,直到部分細(xì)胞邊緣開始脫落時(shí),吸取正在消化的胰酶吹打細(xì)胞收集到裝有3-4mL完*培養(yǎng)基的離心管中,此時(shí)瓶底還有部分細(xì)胞未被吹下(若細(xì)胞已經(jīng)全部被吹下,直接進(jìn)行第6步);
5. 加1mL新的胰酶到培養(yǎng)瓶,放進(jìn)培養(yǎng)箱繼續(xù)消化瓶中剩下的細(xì)胞,直到輕拍培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以脫落,立即加入1mL含血清的培養(yǎng)基終止消化,轉(zhuǎn)移到上一步的離心管中;
6. 輕柔吹打離心管中細(xì)胞懸液,使細(xì)胞分散;
7. 1000rpm,3min離心收集細(xì)胞;
8. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基;(T25推薦10mL,T75推薦15mL);
9. 離心完成后,棄上清,加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞,將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,十字法或8字法混勻,然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)再觀察,注意培養(yǎng)瓶蓋透氣。
04Caco-2細(xì)胞凍存方法
1. 配制程序性凍存液,準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記。
Tips:
推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO
2. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心、棄上清,獲得細(xì)胞沉淀;
3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中;
4. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;
5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置
Tips:
液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性,若活性合格即可長期保存。
程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
T25培養(yǎng)瓶長滿通??蓛龃?-3管,10cm皿長滿通??蓛龃?-4管。
凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。
05Caco-2細(xì)胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;
2. 將細(xì)胞從液氮罐取中出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴,融化過程不超過2min;
Tips:
若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。
凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù),避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。
水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。
3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會有差異
4. 離心完成后棄上清,用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;
5. 復(fù)蘇48小時(shí)后觀察,若細(xì)胞已貼壁,換液一次,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞未貼壁,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)再觀察。
Tips:
1. 整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
2. 該細(xì)胞貼壁需要穩(wěn)定的環(huán)境,復(fù)蘇完成后請勿頻繁將細(xì)胞拿出觀察。
06Caco-2細(xì)胞培收貨攻略
常溫細(xì)胞
1. 收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;
2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(首*傳代比例建議1:2),若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng);
凍存細(xì)胞
1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長期保存,若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;
2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;
3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作;
Tips:
1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時(shí),及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員;
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng);
07常見問題及解決方案
細(xì)胞密度怎么計(jì)算的?
嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實(shí)際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時(shí)碎片比較少,傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。
NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久?
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的,不能完*規(guī)定消化時(shí)間,以實(shí)際消化效果和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。
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