細(xì) 胞 基 本 情 況
▲細(xì)胞正常生長形態(tài)照片
細(xì)胞名稱:PK-15(豬腎細(xì)胞)
細(xì)胞別稱: PK(15); PK (15); PK 15; PK15; Porcine Kidney-15
細(xì)胞貨號: SNL-131
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣,95%;二氧化碳 (CO2),5%
細(xì)胞簡介: PK-15細(xì)胞是由Stice·E于1955年從成年豬的腎臟中分離后建系的,是PK-2a細(xì)胞的克隆系。PK-15細(xì)胞豬圓環(huán)病毒(PCV)抗原陽性,表達纖溶酶原激活劑、角蛋白,可用于多種病毒的增值及特性研究。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),PK-15細(xì)胞內(nèi)有C-型病毒顆粒存在,是研究C-型病毒的材料。美國農(nóng)業(yè)部的外國動物疾病診斷實驗室已經(jīng)確定ATCC CCL-33沒有感染霍亂病毒或非洲豬瘟病毒,可以用來篩選這些病毒。
PK-15(豬腎細(xì)胞)特點
01 細(xì)胞貼壁較強
細(xì)胞貼壁略偏強,消化時易出現(xiàn)消化時間偏長現(xiàn)象,注意一定要消化到細(xì)胞可以輕輕吹下,再加終止液終止消化;
02 細(xì)胞顆粒比較多
該細(xì)胞培養(yǎng)過程中代謝會產(chǎn)生較多顆粒物,細(xì)胞內(nèi)部及細(xì)胞周邊可以明顯看到很多顆粒,此為該細(xì)胞正常現(xiàn)象,并不代表細(xì)胞狀態(tài)不佳或污染;消化操作不規(guī)范、培養(yǎng)條件不適等會導(dǎo)致細(xì)胞顆粒進一步增加,嚴(yán)重的可能會出現(xiàn)細(xì)胞不長甚至死亡,對環(huán)境和操作要求偏高;
細(xì)胞顆粒較多時可以收集細(xì)胞后低速離心并用PBS重懸后再低速離心,重復(fù)1-2次后再接種到新的培養(yǎng)瓶中;
03 細(xì)胞消耗培養(yǎng)基偏快
細(xì)胞培養(yǎng)基消耗速度偏快,必須多加點培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,T25瓶加10-12ml完*培養(yǎng)基,10cm皿加12-15ml,2-3天換液一次;
細(xì) 胞 收 貨 攻 略
常溫細(xì)胞
1.T25瓶收貨后,拆開外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上;
2.吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml,顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,觀察細(xì)胞密度,若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代(首*傳代比例建議1:2),若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng);
凍存細(xì)胞
1.細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查,若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內(nèi)復(fù)蘇)短期保存或液氮中長期保存,若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決;
2.凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,以免超出售后期,復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略;
3.復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員,在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作;
TIPS:
1.細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時,及時拍照聯(lián)系銷售人員;
2.該細(xì)胞運輸過程中由于條件不適,顆粒可能會增多,一定要充分平衡細(xì)胞后再處理,有條件的建議放培養(yǎng)箱過夜再處理細(xì)胞;
3.尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基,可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng);
細(xì) 胞 傳 代 攻 略
1. 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基,再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細(xì)胞10-20s,吸走潤洗的PBS;
2. T25瓶加1ml左右胰酶,輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細(xì)胞層,將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化;
3. 消化到細(xì)胞間隙變大,但未完*脫落時加2-3ml完*培養(yǎng)基終止胰酶消化;
4. 混勻細(xì)胞,900rpm離心3-5min,棄上清;
5. 加新的完*培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞,均勻分到新的培養(yǎng)瓶里,補足完*培養(yǎng)基,將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);
TIPS:
1. 該細(xì)胞對消化時間偏長,注意略微延長消化時間;
2. 對于消化細(xì)胞程度,客戶如果經(jīng)驗不多,無法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時間,建議客戶按照下述操作:胰酶首先復(fù)溫到室溫后加入細(xì)胞,放入37度培養(yǎng)箱,然后每隔30秒,即吹打下細(xì)胞(此時吹打細(xì)胞應(yīng)盡量輕柔,不能強行將細(xì)胞吹下,否則細(xì)胞可能出現(xiàn)機械損傷),如果能夠吹打散細(xì)胞,說明細(xì)胞消化完成可以終止消化,如果30秒吹打不下,再等30秒重復(fù)操作直至能夠輕柔的吹下細(xì)胞;
3. T25瓶加10-12ml完*培養(yǎng)基,10cm皿加12-15ml,2-3天換液一次。
4. 細(xì)胞收貨后首*傳代建議按1:2傳代,后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細(xì)胞生長狀態(tài)和密度情況決定傳代比例;
5. 傳代后24h建議觀察細(xì)胞并換液一次去除死亡細(xì)胞;
細(xì) 胞 凍 存 攻 略
凍存步驟
1. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心,至傳代步驟4,棄細(xì)胞上清,獲得細(xì)胞沉淀;
2. 加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的凍存管中;
3. 將凍存管放入程序性凍存盒,放入-80℃冰箱過夜;
4. 轉(zhuǎn)移細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置,液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性,若活性合格即可長期保存,若低于80%建議重新凍存;
TIPS:
1. 檢測凍存細(xì)胞活性結(jié)果未合格前,培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認(rèn)凍存合格方可視需要丟棄;
2. 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程;
3. T25培養(yǎng)瓶長滿通??梢詢龃?-3管,10cm皿長滿可以凍存3-4管;
細(xì) 胞 復(fù) 蘇 攻 略
復(fù)蘇步驟
1. 將所需的完*培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復(fù)蘇;
2. 準(zhǔn)備37度溫水,將細(xì)胞從液氮罐取中出,觀察管內(nèi)無液氮的情況下,捏住管蓋,將細(xì)胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃,融化至米粒大小冰塊,終止水??;
3. 將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min,不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異;
4. 離心完成后棄凍存液,用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,并輕柔重懸細(xì)胞后接種至T25或者10cm皿中,輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱;
5. 24h后觀察細(xì)胞并換液一次,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng);
TIPS:
1. 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,取出細(xì)胞時震動不要過大,水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,若有液氮建議靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴;
2. 水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率;
3. 水浴至剩米粒大小時及時終止水浴,避免過度水浴或水浴時間不足;
4. 建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細(xì)胞,避免再次轉(zhuǎn)移細(xì)胞;
5. 復(fù)蘇后的細(xì)胞比較脆弱,吹打和轉(zhuǎn)移細(xì)胞時盡量輕柔,復(fù)蘇24h后換液去除死亡細(xì)胞;
常見問題及解決方案
細(xì)胞密度怎么計算的?
嚴(yán)格意義上,細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量,但在實際培養(yǎng)過程中,并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計數(shù)。因此,常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值,貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,當(dāng)然這種表達方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式;
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理?
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,這個屬于細(xì)胞自身特性,無法清除也無法改變,大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象,只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,混勻細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞,再離心后,用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果平時碎片比較少,傳代時可以省略PBS重懸的步驟;如果碎片很多,建議PBS多洗幾次。
NO.3細(xì)胞具體消化時間是多久?
每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的,不能完*規(guī)定消化時間,以實際消化效果和客戶經(jīng)驗為準(zhǔn)。
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