大鼠滑膜細(xì)胞的制備方法:
滑膜細(xì)胞的培養(yǎng):將分離的滑膜組織用含青霉素200kU/L、鏈霉素200mg/L的D-Hank's液漂洗3次以減少污染機(jī)會;去掉脂肪組織,將16個滑膜組織樣本平均分為A、B兩份。將A份不加處理分為A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8八個樣品,將B份用手術(shù)剪剪碎后分為B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8八個樣品。分別采取4種不同方法進(jìn)行處理。
1)不加消化酶消化法:分別將A1、A2、B1、B2離心洗滌2次(2500r/min,離心6min),吸棄上清液,加入100μL100%的FBS混勻,用移液槍吸出注入培養(yǎng)瓶中,放入CO2培養(yǎng)箱烘干15min,再將A1、B1加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS吹打均勻,A2、B2用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁,再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。
2)加Ⅱ型膠原酶消化法:將A3、A4、B3、B4離心洗滌2次(2500r/min,離心6min),吸棄上清液,吸取膠原酶Ⅱ至離心管中,輕輕吹打使組織塊重新懸浮,移入培養(yǎng)瓶,放入CO2培養(yǎng)箱消化,觀察組織成絮狀后,加入1mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化,用移液槍吸出,移入離心管離心(2500r/min,離心6min),棄上清液,放入培養(yǎng)瓶中,A3、B3加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS,吹打均勻;A4、B4用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁,再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。
3)加胰蛋白酶消化法:將A5、A6、B5、B6離心洗滌2次(2500r/min,離心6min),吸棄上清液,吸取胰蛋白酶至離心管中,輕輕吹打使組織塊重新懸浮,移入培養(yǎng)瓶,放入CO2培養(yǎng)箱消化,觀察組織成絮狀后,加入體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化,用移液槍吸出,移入離心管離心(2500r/min,離心6min)。棄上清液,放入培養(yǎng)瓶中,A5、B5加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS,吹打均勻;A6、B6用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁,再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。
4)先加Ⅱ型膠原酶消化法再加胰蛋白酶消化:將A7、A8、B7、B8離心洗滌2次(2500r/min,離心6min),吸棄上清液,吸取膠原酶Ⅱ至離心管中,輕輕吹打使組織塊重新懸浮,移入培養(yǎng)瓶,放入CO2培養(yǎng)箱消化,觀察組織成絮狀后,取出培養(yǎng)瓶,仔細(xì)吹打使組織塊分散,將未黏附細(xì)胞移入離心管離心(2500r/min,離心6min),棄上清液,再加D-Hank's液洗滌,離心,吸棄洗滌液,重復(fù)離心3次,吸取胰蛋白酶至離心管中,輕輕吹打使組織塊重新懸浮,移入培養(yǎng)瓶,放入CO2培養(yǎng)箱消化,消化結(jié)束取出培養(yǎng)瓶,加入體積分?jǐn)?shù)20%FBS終止消化,用移液槍吸出,移入離心管離心(2500r/min,離心6min)。棄上清液,放入培養(yǎng)瓶中,A7、B7加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%FBS,吹打均勻;A8、B8用少量體積分?jǐn)?shù)20%的FBS人工貼壁,再加入3mL體積分?jǐn)?shù)20%的FBS。
5)結(jié)果:培養(yǎng)9d后,觀察各培養(yǎng)瓶中細(xì)胞的成活個數(shù)和生長狀況,組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞得數(shù)為2.03×106,是所有培養(yǎng)方法中細(xì)胞的數(shù)最多的。細(xì)胞活力為95%,與組織剪碎加膠原酶Ⅱ消化后人工貼壁培養(yǎng)同為各種培養(yǎng)方法中細(xì)胞活力*強(qiáng)的,綜合考慮*方法為組織剪碎不加消化酶人工貼壁培養(yǎng)。