細(xì)胞一般儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無(wú)限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。

細(xì)胞復(fù)蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細(xì)胞恢復(fù)到一般的生長(zhǎng)狀態(tài)，今天我們來(lái)看看原代細(xì)胞的復(fù)蘇步驟。

一、檢查

收到細(xì)胞株包裹時(shí)，請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請(qǐng)立即處理告訴寄方。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開(kāi)始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70 °C，隔夜后，移到liq N2)。

二、冷凍細(xì)胞解凍

1、依據(jù)細(xì)胞株說(shuō)明書(shū)規(guī)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類(lèi)、血清種類(lèi)和其它規(guī)定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。

絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同的血清種類(lèi)，若因?qū)嶒?yàn)需要，必須有所不同時(shí)，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。

2、 FBS (fetal bovine serum, 胎牛血清), CS (calfserum, 小牛血清)和HS (horseserum, 馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異較大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料規(guī)定的血清種類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞。

3、將培養(yǎng)基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化后，以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

4、依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)和濃度，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取10 ml 培養(yǎng)基加至T25 或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5、對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1 % 以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。

對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO 敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO 者，則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再放入37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

三、收到T25 flask 細(xì)胞時(shí)的處理方式

1. 于寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡，T25 flask 均加滿(mǎn)培養(yǎng)基。請(qǐng)檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象，若有任何問(wèn)題，不要打開(kāi)蓋子，請(qǐng)立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。

2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至37 °C，并讓運(yùn)送過(guò)程中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長(zhǎng)。

隔天后，于無(wú)菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長(zhǎng)滿(mǎn)盤(pán)，則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。

四，細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)

1、整個(gè)復(fù)蘇過(guò)程盡量手腳麻利一些，戰(zhàn)線拉得太長(zhǎng)可能影響復(fù)蘇效果;

2、由于“化冰”這一步里凍存管與水溫差太大，尤其是液氮里來(lái)的凍存管，放到水里可能會(huì)造成翻江倒海的既視感，所以可以用鑷子夾住凍存管往水里摁，這樣即使有炸裂的情況也會(huì)有水做緩沖;

3、取凍存管時(shí)要謹(jǐn)防凍傷，尤其是夏天，盡管熱也盡量穿長(zhǎng)袖白大褂，一些不經(jīng)意的動(dòng)作可能會(huì)把你的小鮮肉“粘”到冰箱門(mén)上;

4、離心這一步也可以在凍存管里的冰融化后直接進(jìn)行，也就是直接把凍存管離心，離心后棄去原來(lái)的凍存液，然后直接加*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接著把細(xì)胞轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿/瓶里培養(yǎng)。這種方法也許不能將DMSO清除得很干凈，但是基本影響不大。

5、 復(fù)蘇第二天記得去看看細(xì)胞，如果狀態(tài)還不錯(cuò)的話就說(shuō)明復(fù)蘇成功。